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多表位重组疫苗的研究

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    多表位疫苗(multiepitope vaccine)也称鸡尾酒式疫苗,是同时携带多个与目标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。多表位疫苗是由基于抗原表位的氨基酸序列制备的,是近年发展起来的一种独特的疫苗设计思路,代表了一种疫苗设计的新方向,对它的研究是基因工程疫苗研究领域里的热点之一。与传统疫苗相比,多表位疫苗有很多优势:能被具有多种遗传背景的MHC分子识别、结合,从而得到高效的递呈;在细胞免疫方面具有独特的优势,可有效应对病原微生物的变异和免疫反应中的诸多不利因素。文章综述了多表位疫苗的研究进展及应用。

1  多表位疫苗的研究进展

1.1  抗原表位的预测

    抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,又称抗原决定簇,包括B细胞表位和T细胞表位,前者诱导机体产生体液免疫反应,后者则诱发CTL效应。构建多表位疫苗的首要问题是如何准确预测和筛选有效的特异性抗原表位,传统的方法有化学法、合成重叠肽法、酶解法、洗脱法及噬菌体展示技术等。虽然合成重叠肽法具有覆盖面广的优点,但总体来说该方法耗时、费力、方法复杂、费用较高。

    根据已有的表位数据资料,通过计算机软件对氨基酸(或碱基)序列进行分析,可迅速地预测出候选抗原表位。在B细胞表位的预测中,Hoop J P等人首先提出了用亲水性参数对抗原表位进行预测的方法,之后又有很多参数与算法问世,极大地促进了对B细胞抗原表位的研究。在B细胞表位的预测方法中,现被认可的主要有6种:亲水性方案、电荷分布方案、可及性方案、可塑性方案、抗原性方案、二级结构预测方案。遗憾的是这些预测方案的理论值与试验结果存在不同程度的偏差,一般可综合考虑上述方案以期得到满意的结果。

    T细胞表位的预测对新型疫苗的设计同样具有重要意义。人们发现了与MHCI类分子结合的抗原肽的某些特征:长度较短且均一,一般为9个氨基酸;呈线性结构,与MHC I类分子结合,具有一些锚定残基;在序列的特定位置上有锚点的存在;其羧基端多由脂肪族疏水性氨基酸组成。同一种MHC I分子可识别具有某些共同特征结构(基序)T细胞表位,基于抗原基序的数据资料可以对一些病原体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位(内源性抗原的T细胞表位)进行比较精确的预测。但在MHCⅡ类分子抗原表位(外源性抗原的T细胞表位,被Th细胞识别)的预测方面,因其抗原基序不如MHC I类分子明确,故应用较少。T细胞表位的预测存在明显的局限性,预测结果与实际情况都有较大误差。

    目前,预测抗原表位的方法多是由基于连续氨基酸残基构成的线性表位设计的,较少涉及大多数的构像型表位,因此预测抗原表位的方法有待进一步完善。对预测出的抗原表位需进行综合评价,筛选出具有针对性的候选抗原表位,最后需用试验进一步来验证。

1.2  抗原表位的选择

    为使机体获得最佳免疫保护,构建多表位疫苗时需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性,针对性地选择目的抗原表位。体液免疫和细胞免疫共同构成了机体的免疫应答系统。体液免疫主要是通过B细胞产生抗体来发挥作用的,故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD+4辅助性T细胞(分为Th1Th2两个亚群)应答和CD+8细胞毒性T细胞应答。因此,可根据机体对病原体的免疫应答特点选择特异性的Th1表位、Th2表位或CTL表位来诱导机体免疫应答向ThlTh2CTL应答类型定向发展。

    考虑到疫苗的保护范围,可同时选择目标抗原E的多个B细胞表位和T细胞表位,以诱导特异的体液免疫和细胞免疫,进而发挥预防控制作用,这种设计可以拓宽多表位疫苗的保护谱。若选择的抗原表位来自抗原的保守区域,则可提供不同毒株之间的交叉免疫保护,进而有效应对宿主自身基因高频突变所造成的免疫逃避问题。因此,构建具有交叉保护作用的可准确到达靶标的多表位疫苗可能是预防具有多血清型及高突变率病毒(如禽流感病毒)感染的有效途径。

l.3  多表位疫苗的设计

1.3.1  直接串联设计  直接将多个抗原表位首尾相连形成聚合抗原表位,是一种最直接的方法,既可提高抗原表位的免疫原性,也可做到对各个抗原表位的准确定量。Alexander J等人用人工合成的办法获得了包含lO个抗原表位的多肽并用其免疫小鼠。结果发现:它可诱导出针对各个抗原表位的免疫应答反应,同时指出由3040个氨基酸组成的多肽才具有良好的免疫原性。如在多个抗原表位串联成较长的线形肽段的同时删除其中的非必要成分,能增强抗原表位的免疫原性和疫苗的安全性,同样可诱导机体的免疫应答。

1.3.2  空间伸展模式  将多个抗原表位与分枝状的多聚赖氨酸骨架耦联,构成多价抗原肽(MAP)。可显著提高抗原表位的免疫原性,能诱导高水平的免疫应答并提供良好的保护力。MAP具有独特的空间结构,可使多个保护性抗原表位在空间上充分伸展,形成立体结构的表位簇,易于抗原表位的运输和递呈,这在鼠系模型中已得到了证实。不足之处是需要化学合成和纯化,制备困难,费用高,应用受到限制。

1.3.3  脂肽模式  将抗原表位肽共价连接到具有免疫佐剂活性的脂质分子上而构建的疫苗被称为脂肽疫苗。脂质分子比较稳定,具有亲脂性,可迅速被动地跨越细胞膜将抗原肽导入细胞内。这种疫苗无需佐剂就可以激发机体强烈的免疫反应,已证实在人体内是安全、有效的。

1.3.4  基因重组表达模式  随着分子生物学和免疫学技术的进步,在构建DNA疫苗时,抗原基因的选择逐渐由编码整个抗原的完整基因转变为编码特异性表位的短基因。多表位核酸疫苗是将多条编码特异性表位的DNA序列以适当方式串联起来,然后重组到真核表达载体中制备而成的。将疫苗注入机体后,在宿主的细胞系统中转录并表达出多个不同的保护性抗原表位,从多个方面诱导机体的免疫应答,且可持续刺激机体的免疫系统,从而提高疫苗的保护力。考虑到基因操作方便,重组质粒构建容易及多表位核酸疫苗具有安全性好、保护力强、应答类型可以有效调控等优点,使基因重组表达模式具有较高的研究和应用价值。目前,在研制病毒性疾病及肿瘤多表位疫苗时,常采用构建多表位核酸疫苗的模式。

1.4  旁侧序列的优化

    在多表位疫苗的侧翼序列中,常引入通用的T细胞表位,这样可在某种程度上克服MHC分子的限制性,在不同个体中诱导出免疫应答。如目的抗原未位与抗原递呈细胞(APC)T细胞表面受体的结台可有效激活T细胞,提高多表位疫苗的免疫功效。在抗原表位连接时,应考虑各抗原表位的间隔序列.以提高蛋白酶水解和抗原表位的递呈效率,增强疫苗的免疫效果,同时还应避免产生新的抗原表位,Livingston B等发现在抗原表位间插入序列为“GPGPG”的柔性短肽,可避免在两抗原表位连接处形成新的抗原表位。有学者通过试验证实:在紧随CTL表位羧基端(被称为C+1)是带正电荷或酰氨类的氨基酸时,可优化CTL表位的递呈,提高免疫原性;在紧随CTL表位氨基端(N+1)是酪氨酸时,也有类似功能。C+1位和N+1位氨基酸的优化设计对CTL表位功能的发挥有重要影响。已有试验结果证明,将T(B)细胞表位置于B(T)细胞表位的氨基端所构建的线性多表位疫苗可诱发机体产生抗B(T)细胞表位的抗体,同时揭示含重复T细胞表位的复合多表位疫苗所诱导的抗体对B细胞表位具有相当高的亲和力。因此,对T细胞表位的优化设计显得尤为重要。

2  多表位疫苗在疫苗研究、开发领域中的应用  多表位疫苗在疫苗研究、开发领域里也取得了丰硕的成果。韦三华等构建了丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体,用该重组质粒免疫小鼠后检测其免疫原性。结果发现:所构建的真核表达载体在细胞中能获得有效表达,用重组质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体和特异性淋巴细胞增殖反应,IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体组和生理盐水对照组。贾雷立等以H3H9亚型流感的HA抗原表位及流感病毒的其他主要抗原表位基因为基础,构建了抗猪流感的复合型多表位核酸疫苗,并在Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白。郑敏等人构建了表达口蹄疫病毒复合多表位基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗,然后分别以3种方式接种牛,其中最佳的一组所诱导的中和抗体水平已接近于常规灭活疫苗免疫水平,并且还可诱导强烈的细胞免疫应答。随着人们对多表位疫苗的深入研究,它将在人类和动物疾病的预防、控制等方面发挥积极的作用。