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荧光素FITC标记抗体的方法

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当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般最多能结合15~20个,一个IgG分子可结合2~8个分子的FITC,其反应式如下
FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白质  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1.Marsshall法
(1)材料    抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/LPBS等。
(2)方法及步骤   
①抗体的准备  取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
     ②荧光素的准备  根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量。
     a.蛋白溶液:含量Amg/m1;容积Bml。
     b.总蛋白量(AXB)=Crag。
     c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。
     d.荧光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。
     e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D/10=Fml。
     f. PBS量D-(B+F)=Gml。
注:A为蛋白含量,mg/ml;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mg;D为常数,mg;正为荧光素的量,mg;F为碳酸盐缓冲液的容积,ml;G为PBS的容积,ml。
     ③结合(或标记)  边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
     ④透析  结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0~4~C)过夜。
     ⑤过柱  取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍左右)。
2.Chadwick法
(1)试剂和材料    抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。
(2)方法及步骤   
 ①抗体准备  用o~4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中。
     ②荧光色素准备  按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算,称取所需的荧光素,用3%碳酸钠水溶液溶解。
     ③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在o~4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18~24h。
     ④透析和柱层析  方法同Marsshall法。